X
تبلیغات
دوره 17 علوم آزمایشگاهی سمنان - الكتروفورز DNA روي ژل آگارز

پروتكل (الكتروفورز DNA روي ژل آگارز) Electrophoresis

 

الكتروفورز:

يكي از پركاربردترين تكنيك ها در بيولوژي مولكولي الكتروفورز نام دارد كه اساس آن بسيار ساده است. لغت فورز به معناي حركت و تحرك است و الكتروفورز در واقع حركت ذرات تحت تأثير ميدان الكتريكي را گويند.

در اين تكنيك مولكول هاي DNA براساس بار و وزن مولكولي آنها جدا مي شوند.

 

الكتروفورز DNA روز ژل آگارز:

نماي ساده از دستگاه الكتروفورز:

دستگاه الكتروفورز شامل يك محيط خلاء، يك الكترود منفي و يك الكترود مثبت در دو طرف ذره باردار مي باشد. اسيدهاي نوكلئيك داراي بار الكتريكي هستند. گروه هاي فسفات روي اسيدهاي نوكلئيك داراي بار منفي هستند. بنابراين رشته DNA داراي بار الكتريكي منفي مي باشد.

وقتي كليد باز است يا به عبارتي جريان الكتريكي قطع مي باشد ذره موردنظر در ميدان الكتريكي ثابت است و زماني كه كليد بسته است يا به عبارتي جريان الكتريكي وصل باشد ذره موردنظر به تنهايي و با سرعت شتابدار تا رسيدن به الكترود مثبت حركت كرده و برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز همواره از الكترود منفي به سمت الكترود مثبت است. البته اين مطلب در مورد رشته DNA كه داراي بارالكتريكي منفي است صادق است.

تحرك الكتريكي معيار اصلي سنجش در جداسازي مولكول هاست. وجود ضريب اصطكاك f يك عامل مقاوم براي تحرك است. درحالي كه وجود بار باعث زودتر رسيدن ذره به قطب است. هرچه ذره بزرگتر باشد و شكل آن از حالت كروي دور باشد ضريب اصطكاك f بيشتري داشته و تحرك الكتريكي كمتري داراست.

درواقع تحرك الكتريكي هر ذره وابسته به شكل و اندازه ذره و بار ذره است و ضريب اصطكاك نيز كميتي است كه ارتباط مستقيم با اندازه و شكل ذرات دارد هرچه ذره به شكل كروي نزديكتر باشد ضريب اصطكاك كمتري دارند.

 

 

 

وسايل موردنياز در الكتروفورز:

1. دستكش

2. كست (cast) و كمب (comb)

3. ترازو (Balance)

4. سمپلر

5. ماكروويو

6. تانك الكتروفورز

7. Power supply (جهت برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز)

8. دستگاه عكسبرداري Gel Doc

 

مواد موردنياز:

1. پودر آگارز

2. EtBr : اتيديوم برمايد (ماده اي بسيار سمي و موتاژن قوي است)

3. TBE 1x

4. Loading Buffer

5. Marker

6. آب مقطر

 

1) ژل آگارز:

يك ژل پايدار است و قطر روزنه هاي آن بسيار بزرگ است و براي جداسازي ماكرومولكول ها و سوپر مولكول ها استفاده مي شود. از ژل آگارز در الكتروفورز هم به صورت عمودي و هم به صورت افقي استفاده ميشود. اين ژل را در درصدهاي مختلف تهيه مي كنند كه اين مطلب به اندازه قطعه موردنظر بستگي دارد. يعني هرچه اندازة قطعه موردنظر بزرگتر باشد غلظت ژل كاهش مي يابد و برحسب اندازه قطعه ژل آگارز را در cast 60 cc, cast 30 cc تهيه مي كنند.

بطور مثال: براي قطعه اي با ميزان 100 bp از ژل آگارز 5/2% استفاده مي كنيم. كمترين درصد ژل آگارز در حدود 6/0% مي باشد.

 

 

 

 

Et.Br: (اتيديوم برومايد):

     100

    cc  

      25

شديداً موتاژن است و بسيار سمي است از تنفس بخارات آن بايد پرهيز نمود و پسمانهاي مرتبط با اين ماده بايد در داخل گالن هايي كه بر سر آنها يك قيف ايمني متصل است دفع شود. فرمول شيميايي اين ماده c21H20Brn3 مي باشد. وزن مولكولي اتيديوم برومايد Mw=394/3 و غلظت نهايي آن

ميلي گرم مي باشد.

 

اتيديوم برومايد

EB

C21H10Brn3

فرمول شيميايي

 

غلظت نهايي

3/394

(  وزن مولكولي ) mw

46045

Cat No

فولوكا

شركت توليد كننده

 

 

Loading Buffer   :

تركيبات اين ماده عبارت است از برموفنل و سوكروز و فرمول شيميايي سوكروز عبارت است از C21H22O11  و وزن مولكولي 3/342=Mw  حركت اين رنگ نشان دهنده حركت محلول آن بوده يعني حركت آن علاوه بر صحت انجام كار يك شاخص براي اندازه گيري و حركت محلول در داخل ژل است .

 

 

طرز تهيه Loading Buffer  :

سوكروز 40% و برموفنل 25% را با يكديگر مخلوط كرده محلول حاصل Loading Buffer  نام دارد.

 

سوكروز

برموفنل بلو

Loading Buffer

C12H22O11

C19H9Bro45SNA

فرمول شيميايي

3/342

9/691

( وزن مولكولي ) mw

gr   500

gr    25

W ( وزن )

S-0389

B-8026

Cat No

 

TBE :

تركيبات اين ماده به قرار زير است. تريس، EDTA ، بوريك اسيد

 

بوريك اسيد

EDTA

تريس

TBE

H3BO3

C10H14N2Na2OH+H2O

 

فرمول شيميايي

83/61

24/372

14/121

‍( وزن مولكولي ) mw

00162/1

08421/1

08421/1

Cat No

مرك

مرك

مرك

شركت توليد كننده

 

 

روش كار:

1. پودر آگارز را وزن كرده و درون بشر يا ارلن بريزيد.

2. TBE lox را كه در دسترس است توسط آب مقطر به نسبت 10:1 رقيق كرده و بدين طريق TBE lx را بسازيد.

3. كمب (Comb) را بر روي كست (Cast) موردنظر قرار دهيد و فاصله بين Comb , Cast را 1mm درنظر گرفته وب راساس اين فاصله جايگاه comb بر روي cast را تنظيم كنيد.

4. TBE lx را براساس حجم موردنظر توسط استوانه مدرج داخل ارلن يا بشر ريته و به آهستگي تكان دهيد.

5. محلول داخل ارلن را در داخل ماكروويو قرار داده يا بجوشانيد بطوري كه ذرات، آگار داخل آن كاملاً حل شده و ذره اي داخل آن نباشد و محلول يكنواخت گردد. و سپس محلول موردنظر را سرد كنيد.

6. به محلول درون بشر در حدود (1-2m) از اتيديوم برومايد توسط سمپلر اضافه كنيد.

7. محلول را تكان دهيد تا اتيديوم برومايد كاملاً در آن حل شده و محلول يكنواخت گردد.

8. محلول درون بشر را به آرامي درون cast ريخته و در حدود min20 صبر كنيد تا ژل آگارز بسته شود.

9. ژل را به همراه cast داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد و جاي آن را ثابت كنيد و سپس تانك را تا كمي بالاتر از ژل توسط TBE lx پر كنيد.

 

 

طريقه ران كردن (Running Procedure)

1. به تيوبهاي حاوي نمونه به ازاء هر 5ml از نمونه موردنظر در حدود 1ml از Loading Buffer به آن اضافه كرده و خوب Pipeting كنيد.

2. بوسيله سمپلر محتويات درون هر tube را داخل چاهك از سمت چپ به راست از ژل run كنيد و در آخرين چاهك نيز ماركر را ران كنيد.

3. جريان الكتريكي در حدود (120v) 120 ولت به تانك وصل كنيد تا محلول run شده از چاهكها خارج شود و سپس ولتاژ را پائين آوريد و در ولتاژ حدوداً بين 80  تا 90 ولت قرار دهيد.

4. پس از حدوداً 45 دقيقه ژل را از تانك خارج كنيد و سپس از كست (cast) تير خارج كرده و در  داخل دستگاه Gel Doc قرار دهيد.

5. پس از قراردادن ژل در داخل دستگاه عكس ژل را بگيريد.

 

 

كار دستگاه ژل داك: Gel Cod

1- ژل را از كست خارج كرده و داخل دستگاه Gel Doc قرار داده و جايگاه ژل را تنظيم كرده و درب دستگاه را ببنديد.

2- مانيتور را روشن كرده و از طريق مانيتور محل قرارگرفتن ژل را تنظيم كنيد.

3- سپس اشعه uv را روشن كرده تا باندها نمايان شوند.

4- با كليد (+) و (-) نور را زياد و كم كنيد.

5- وقتي باندها مشخص شد ابتدا كليد save را فشار دهيد و سپس كليد print را روي دستگاه printing فشار دهيد و عكس ژل را بگيريد.

6- سپس uv را خاموش كرده و تمام دستگاه ها را نيز خاموش كرده و ژل را از دستگاه Gel Doc خارج نمائيد.

 

 

نتيجه گيري:

از مقايسه باندها با باندهاي ديگر و همچنين ماركر marker و نمونه normal مي توان تغييرات و موتانتها را تشخيص داد و يا حتي وجود يا عدم وجود DNA رايتر را مشخص كرد.

ايجاد باند و تأثير uv روي آن وجود DNA را ثابت مي كند.

 

+ نوشته شده توسط علی محمد قاسمی در جمعه 18 مرداد1387 و ساعت 15:21 |